实验专栏丨今日掐指一算，你命里缺套Transwell精华版！
中洪君今日掐指一算，注定有些不寻常的事情要发生，翻阅黄历，今日大吉，宜迁移，动土…然后，这难道不是上天在召唤你做迁移/侵袭实验吗？
在肿瘤相关的研究中，利用transwell小室检测肿瘤细胞的迁移及侵袭能力是十分常见的功能学实验，现在中洪君就带你踏上了技能“get”之路。
1. 无基质胶 Transwell 小室制备
① 包被基底膜：
如果用50mg/L的Matrigel的话 ，按1:8稀释液包被Transwell小室底部膜的上室面，置4℃风干。如果需要在下室面铺FN的话，可将200ul枪头的尖端剪掉,吸取FN均匀涂抹在小室的下面。
如果用胶原（collagen）的话，一般配成0.5mg/ml，直接用枪吸了涂在膜上。
② 水化基底膜
吸出培养板中残余液体，每孔加入 50 uL 含 10 g/L BSA 的无血清培养液，37℃，30 min。
另一方法：在上室的聚碳酸酯膜上加入稀释后的 Matrigel （3.9 μg/μL）60-80 μL （注意体积不可太大，以刚把聚碳酸酯膜浸湿为最好），置 37℃ 30 min 使 Matrigel 聚合成凝胶。
2.有基质胶的 Transwell 小室制备
将小室放入培养板中，在上室加入300µl预温的无血清培养基，室温下静置15－30min，使基质胶再水化，再吸去剩余培养液。
1. 制备细胞悬液前可先让细胞撤血清饥饿 12－24 h，进一步去除血清的影响。但这一步并不是必须的。
2. 消化细胞，终止消化后离心弃去培养液，用 PBS 洗 1－2 遍，用含 BSA 的无血清培养基重悬。调整细胞密度至 1-10×100 000，个人认为不要超过 5×100 000，具体密度要自己摸索。
三、
1. 取细胞悬液 100－200 μL 加入 Transwell 小室，不同公司的、不同大小的 Transwell 小室对细胞悬液量有不同要求，请参考说明书。24 孔板小室一般 200 μL。
2. 24 孔板下室一般加入 500 μL 含 FBS 或趋化因子的培养基，不同的培养板加的量有不同要求，具体请参考说明书。这里要特别注意的是，下层培养液和小室间常会有气泡产生，一旦产生气泡，下层培养液的趋化作用就减弱甚至消失了，在种板的时候要特别留心，一旦出现气泡，要将小室提起，去除气泡，再将小室放进培养板。
3. 培养细胞：常规培养 12－48 h（主要依癌细胞侵袭能力而定）。在培养过程中，膜下会逐渐有少量小气泡产生，这是正常现象，可不予处理，但我遇到过培养一段时间后，膜下出现了大气泡，幸亏及时发现，否则后果将非常严重。因此，个人建议，最好接种细胞后1－2h把培养板从培养箱里拿出来看看，确信没有大气泡产生。
四、
取出Transwell小室，弃去孔中培养液，用PBS清洗2遍，甲醇固定半小时，将小室适当风干。0.1%结晶紫（0.1%结晶紫配制的方法：称0.1g溶解到100ml蒸馏水中）染色20 min，用棉签轻轻擦掉上层细胞，用PBS洗3遍。400倍显微镜下随即五个视野观察细胞，记数。
注意：
细胞迁移实验和侵袭实验的区别，细胞迁移实验不需要铺胶，培养时间大约24到48小时，一般48小时
五、
最后，作为失败中趟过的实验狗，中洪君和小伙伴一起交流，也汇总了细胞迁移及侵袭中10大常见问题及解决办法，由于文字繁多，后台回复“细胞迁移1”或者加小编微信：
六、
（点击图片即可放大查阅）
为了更好、更快速的解决大家的问题，公众号开通人工在线咨询了，扫描最下方二维码加关注，中洪博元公众号菜单包括：科研干货、必领特权、在线咨询
欢迎右下角留言
和中洪君一起来聊聊实验那些事
文末福利：
转载请注明来源，更多精彩内容扫描下方二维码，实验咨询微信zhbybio